Polimorfizm w regionie promotora CTGF związany ze stwardnieniem rozsianym ad 7

Natomiast po dostosowaniu do grupy autoprzeciwciał nie stwierdzono istotnego związku u pacjentów z twardziną układową pomiędzy liczbą kopii alleli G a obecnością lub brakiem rozproszonego zajęcia skóry, nadciśnieniem płucnym lub kryzysem nerkowym (Tabele 3 i 4 Dodatkowego Dodatku ). Analiza aktywności promotora
Zbadaliśmy, czy polimorfizm w pozycji -945 wpływa na aktywność transkrypcyjną promotora CTGF w pierwotnych fibroblastach płucnych. Wybraliśmy te komórki, ponieważ płuca są najsilniej zaangażowanym narządem w naszym badaniu, a fibroblasty są głównymi producentami CTGF w płucu.27 Sklonowaliśmy fragmenty 1,6-kb DNA zamplifikowane przez PCR obejmujący obszar polimorficzny od pacjentów z określonym CC lub GG genotypy (pięć w każdej grupie) do konstruktu promotor-reporter 4,5 kb (p-4.5-CTGF-Luc) (Figura 1B), a genotyp zweryfikowano przez sekwencjonowanie. Testy przejściowej transfekcji z użyciem tych konstruktów promotor-reporter wykazały znacznie wyższą aktywność transkrypcyjną dla konstruktów alleli G, zarówno w warunkach podstawowych, jak i po stymulacji trombiną przy U na mililitr (Figura 1C). Stymulacja trombiną wykazała, że bezwzględna aktywność transkrypcyjna w allelu G była trzy razy większa niż w allelu C w warunkach profibrotycznych.
Formacja kompleksu białko-DNA
Figura 2. Figura 2. Działanie Sp3 w preferencyjnym wiązaniu allelu C i represja transkrypcji. W panelu A, oznaczenie przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej (EMSA) z znakowanymi 32P sondami zawierającymi allele C i G w pozycji -945 pokazuje różnicowanie czynnika transkrypcji z G-945C. Nieznakowane oligonukleotydy zastosowano, jak wskazano, jako konkurentów, w celu wykazania swoistości wiązania. Sp1 i wczesna odpowiedź wzrostu (EGR1) są oligonukleotydami w miejscu konsensusu. W panelu B, EMSA z użyciem znakowanej sondy allelu C wraz ze specyficznymi przeciwciałami i kontrolami IgG (koza [G] i królicze [R] IgG) pokazuje, że Sp3 jest głównym czynnikiem wiążącym allel C w pozycji -945. Panel C przedstawia wyniki półilościowego oznaczenia immunoprecypitacji chromatyny, stosując jako przykład dwa kontrolne preparaty fibroblastów, genotyp GG i CC. Wejście (10%) oznacza próbkę DNA przed immunoprecypitacją, rozcieńczoną 10-krotnie i stosowaną jako kontrola pozytywna; IP immunoprecypitacja; i przeciwciało Ab. W panelu D, średnie (+ SE) stosunki produktu PCR Sp1 do Sp3, zmierzone metodą densytometrii, przedstawiono dla zebranych danych z pięciu niezależnych doświadczeń. P <0,01 dla genotypu GG w porównaniu z genotypem CC w komórkach kontrolnych (stosunek zwiększony o czynnik 5,8) i P <0,001 dla genotypu GG w porównaniu z genotypem CC w komórkach od pacjentów z twardziną układową (zwiększoną o współczynnik 3,3). Panel E pokazuje, że Sp3 działa jako represor w -455C. Ekspresja lucyferazy z konstruktu allelowego G, p-4.5-CTGF-Luc (p-4.5G) i odpowiedni konstrukt allelu C (p-4.5C), uzyskany przez ukierunkowaną mutagenezę z p-4.5-CTGF-Luc, jest kotransfekowany wektorem ekspresyjnym dla Sp3 (pSp3) lub pustego wektora ekspresyjnego (pEV). Przedstawione dane to średnie (+ SE) z trzech niezależnych eksperymentów [hasła pokrewne: rehabilitacja dzieci warszawa bemowo, pestki moreli gorzkiej dawkowanie, aparat słuchowy nfz ]