Polimorfizm w regionie promotora CTGF związany ze stwardnieniem rozsianym ad 8

Gwiazdka oznacza P <0,01 dla różnicy między wpływem pSp3 a pEV na p-4.5C w warunkach podstawowych (współczynnik 0,65). Sztylet oznacza P <0,001 dla różnicy między wpływem pSp3 a pEV na p-4,5C po stymulacji trombiną (współczynnik 0,47). Panel F pokazuje proponowany model interakcji miejsca polimorficznego z proksymalnym promotorem w genie CTGF. Bilans złożonych składników i aktywności transkrypcyjnej - na przykład poprzez acetylację (Ac) i fosforylację (P) - prawdopodobnie zależy od utraty wiązania Sp3 w pozycji -945. Deacetylaza histonów (HDAC) i p300, acetylaza histonowa, mogą tworzyć części tego kompleksu razem z białkiem Sp1, Sp3, SMAD i innymi czynnikami. Następnie oceniliśmy interakcje między białkiem i DNA w tym miejscu za pomocą ekstraktów jądrowych fibroblastów i EMSA. Zaobserwowano uderzającą różnicę między allelem G i allelem C, wykazującym silne wiązanie białek jądrowych z allelem C, z dwoma różnymi utworzonymi kompleksami, ale z brakiem wiązania z sondą allelową G (Figura 2A). Ponieważ wariant C stanowi część elementu TCCTCCC (podkreślona podstawa polimorficzna), nietypowe miejsce wiązania Sp1 opisane w genie kolagenu typu I.1, 28 zbadaliśmy, czy kompleksy zawierają takie czynniki. Swoistość wiązania, testowana przez konkurencję z nieznakowanymi oligonukleotydami, wykazała utratę wiązania przy użyciu sondy alleli C i konsensusowego oligonukleotydu Sp1, ale nie z sondą allelową G i sondą konsensusową dla innego czynnika wiążącego bogatego w GC, wcześnie. odpowiedź wzrostu (EGR1) (Figura 2A). Zastosowanie specyficznych przeciwciał typu supershift wykazało, że Sp3 jest głównym czynnikiem wiążącym to miejsce (allel C), ze słabym wiązaniem również Sp1 (Figura 2B).
Przeprowadziliśmy oznaczenie immunoprecypitacji chromatyny przy użyciu fibroblastów płucnych, które były homozygotyczne pod względem cytozyny lub guaniny w pozycji -945. Chromatynę poddano immunoprecypitacji z użyciem specyficznych przeciwciał anty-Sp1 i anty-Sp3, a DNA ekstrahowane z pięciu niezależnych eksperymentów amplifikowano za pomocą PCR specyficznego dla promotora CTGF obejmującego miejsce polimorficzne. Wiązanie Sp3 i Sp1 wykazano zarówno w homozygotycznych komórkach CC jak i GG (Figura 2C), co można wyjaśnić przez obecność flankujących miejsc Sp-factor (co potwierdzono przez sekwencjonowanie). Jednakże wystąpiło silne i znaczące przesunięcie w proporcji wiązania Sp1 do wiązania Sp3 w kierunku wyższych stosunków w komórkach homozygotycznych GG (Figura 2D). Zmiana ta była spowodowana połączeniem umiarkowanej utraty wiązania Sp3 i dramatycznego wzmocnienia wiązania Sp1 (Figura 2C). Różnicę alleliczną obserwowano w komórkach zarówno od pacjentów z twardziną układową, jak i osób kontrolnych, przy czym komórki od pacjentów z twardziną układową miały ogólnie wyższy stosunek wiązania Sp1 do Sp3 niż komórki od osobników kontrolnych.
Mutageneza ukierunkowana na stronę i nadekspresja Sp3
W przeciwieństwie do Sp1, Sp3 ma działać jako represor transkrypcyjny lub jako aktywator, który jest słabszy niż Sp1, ale konkuruje o tę samą stronę. 29 To odkrycie byłoby zgodne z naszym odkryciem, że wzmocniona aktywność transkrypcyjna konstruktów promotora allelu G jest skorelowana z brakiem powiązania Sp3 z tą stroną
[podobne: rudzki twitter, diprogenta maść, aminodral ]