Polimorfizm w regionie promotora CTGF związany ze stwardnieniem rozsianym cd

Typowy SNP, który został wcześniej opisany jako zlokalizowany w pozycji -743 bp od miejsca rozpoczęcia transkrypcji, 17, został następnie włączony do bazy danych dbSNP w pozycji -945 z kodonu start ATG (rs6918698). Ze względu na wysoką częstotliwość występowania i lokalizację SNP w domniemanym elemencie transkrypcyjnym, zbadaliśmy go dalej w naszym badaniu i stosujemy się do oficjalnego źródła jego lokalizacji na -945 w tym artykule. Genotypowanie
Genotypowanie przeprowadzono za pomocą testu reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) z sekwencyjnymi starterami 18, jak wyszczególniono w dodatkowym dodatku. Genotypy 25 losowych próbek potwierdzono przez bezpośrednie sekwencjonowanie za pomocą MGW Biotech.
Hodowlę komórkową
Wyizolowaliśmy fibroblasty płuc, jak opisano poprzednio.19 Komórki hodowano w standardowych warunkach w zmodyfikowanym podłożu Eagle a Dulbecco zawierającym 10% surowicy płodowo-cielęcej. W doświadczeniach przejściowej transfekcji komórki umieszczono w 0,2% surowicy płodowo-cielęcej przez 10 godzin, a następnie traktowano świeżą 0,2% płodową surowicą cielęcą z lub bez U trombiny na mililitr przez 16 godzin. W przypadku testu przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej (EMSA) i oznaczenia immunoprecypitacji chromatyny komórki zebrano po 24 godzinach w 0,2% surowicy płodowej. We wszystkich doświadczeniach z wyjątkiem testu immunoprecypitacji chromatyny stosowaliśmy ten sam preparat komórek, w pasażu 4 do 7, od jednego pacjenta z twardziną układową. Do oznaczenia immunoprecypitacji chromatyny przygotowano genotypy preparatów komórkowych od 13 osobników i wybrano cztery homozygoty: dwie linie kontrolne, genotypy CC i GG; i dwie układowe linie sklerozowe, genotypy CC i GG.
Konstrukty plazmidów i testy aktywności promotora
Aby wytworzyć macierzysty konstrukt promotor-CTGF, sklonowaliśmy 4,6-kb fragment genu CTGF z klonu sztucznego chromosomu pochodzącego z P1 (dostarczonego przez Andrew Mungal, Sanger Institute, Cambridge, Wielka Brytania, numer dostępu GenBank, AL354866) do wektor reporterowy lucyferazy (Luc) pGL3 (Promega) (patrz Dodatek dodatkowy). Ten konstrukt, który zawiera 4,5 kb sekwencji promotora CTGF, oznaczono jako p-4.5-CTGF-Luc. Zamplifikowano fragment o długości 1,6 kb obejmujący polimorfizm od dziewięciu niespokrewnionych osobników, którzy wcześniej byli genotypowani jako homozygoty. Po trawieniu enzymem restrykcyjnym, które generuje miejsca kompatybilne z PmeI i SacII na końcach, powstałe 1,5-kb fragmenty wklonowano do macierzystego konstruktu p-4.5-CTGF-Luc. 10 konstruktów przejściowo transfekowano do ludzkich fibroblastów płucnych przez noc z użyciem Fugenu 6 (Roche). Po traktowaniu, komórki poddano lizie z użyciem Reporterowego Buforu Lysis Reportera (Roche), a lucyferazę mierzono za pomocą odczynników lucyferazy (Promega) w chemiluminometrze (Mithras LB 940, Berthold Technologies). Jako kontrolę skuteczności transfekcji stosowano plazmid reportera promotora kinazy tymidynowej-renilla lucyferazy (pRL-TK, Promega). Testowano potrójne studzienki i eksperymenty powtarzano co najmniej dwa razy. Konstrukt macierzysty, p-4.5-CTGF-Luc, poddano ukierunkowanej mutagenezie za pomocą zestawu QuikChange II XL (Stratagene) w celu zastąpienia guaniny cytozyną w pozycji -945
[przypisy: evra plastry cena, prazolacid, leki osłonowe na żołądek ]